不同的蛋白質分離純化的方法不同,但蛋白質分離純化的操作步驟基本類似,那么如何進行細菌蛋白的提取呢?這里總結細菌蛋白的提取的實驗試劑、操作步驟以及一些注意事項。
實驗試劑
采用T7• Tag Affinity Purification Kit
T7•Tag抗體瓊脂。B/W緩沖液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137mM NaCl,1%吐溫-20,pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1M檸檬酸,pH2.2. 中和緩沖液:2M Tris,pH10.4。 PEG 20000。
實驗步驟
1.100ml 含重組表達質粒的菌體誘導后,離心5000g×5min,棄上清,收獲菌體,用10ml預冷的B/W緩沖液重懸。
2. 重懸液于冰上超聲處理,直至樣品不再粘稠,4℃離心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起,平衡至室溫,裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。
5. 10ml B/W緩沖液過柱,洗去未結合蛋白。
6. 用5ml洗脫緩沖液過柱,每次1ml,洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集,混勻后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中,雙蒸水透析24hr,中間換液數次。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
注意事項
蛋白在過層析柱前,要0.45μm膜抽濾,否則幾次純化后,柱子中會有不溶物。
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